【實驗目的】
1．了解用逆轉(zhuǎn)錄PCR法獲取目的基因的原理。
2．學習和掌握逆轉(zhuǎn)錄PCR的技術和方法。
【實驗原理】
聚合酶鏈式反應(PCR)過程利用模板變性，引物退火和引物延伸的多個循環(huán)來擴增DNA序列。因為上一輪的擴增產(chǎn)物又作為下一輪擴增的模板，是一個指數(shù)增長的過程，使其成為檢測核酸和克隆基因的一種非常靈敏的技術。一般經(jīng)25-35輪循環(huán)就可使模板DNA擴增達106 倍。RT-PCR將以RNA為模板的cDNA(complement DNA)合成(即RNA的反轉(zhuǎn)錄(RT，reversetranscription))，同cDNA的PCR結合在一起的技術，提供了一種基因表達檢測、定量和cDNA克隆的快速靈敏的方法。由于cDNA包括了編碼蛋白的完整序列而且不含內(nèi)含子，只要略經(jīng)改造便可直接用于基因工程表達和功能研究，因此RT-PCR成為目前獲得目的基因的一種重要手段。
RT-PCR技術靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細胞中基因表達水平、表達差異，細胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。RT-PCR比其他包括Northern印跡、RNase保護分析、原位雜交及S1核酸酶分析在內(nèi)的RNA分析技術，更靈敏，更易于操作。
RT-PCR的基本原理。首先是在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下從RNA合成 cDNA，即總RNA中的mRNA在體外被反向轉(zhuǎn)錄合成DNA拷貝，因拷貝DNA的核苷酸序列*互補于模板mRNA，稱之為互補DNA(cDNA)；然后再利用DNA聚合酶，以cDNA*鏈為模板，以四種脫氧核苷三磷酸(dNTP)為材料，在引物的引導下復制出大量的cDNA或目的片段。
RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進行。兩步法RT-PCR比較常見，在使用一個樣品檢測或克隆多個基因的mRNA時比較有用。在兩步法RT-PCR中，每一步都在*條件下進行。cDNA的合成首先在逆轉(zhuǎn)錄緩沖液中進行，然后取出1/10的反應產(chǎn)物進行PCR。而一步法RT-PCR具有其它優(yōu)點(表4.2)，cDNA合成和擴增反應在同一管中進行，不需要打開管蓋和轉(zhuǎn)移，有助于減少污染。還可以得到更高的靈敏度，zui低可以達到0.1pg總RNA，因為整個cDNA樣品都被擴增。對于成功的一步法RT-PCR，一般使用基因特異性引物(GSP)起始cDNA的合成。
隨機引物法是三種方法中特異性zui低的。引物在整個轉(zhuǎn)錄本的多個位點退火，產(chǎn)生短的，部分長度的cDNA。這種方法經(jīng)常用于獲取5"末端序列及從帶有二級結構區(qū)域或帶有逆轉(zhuǎn)錄酶不能復制的終止位點的RNA模板獲得cDNA。為了獲得zui長的cDNA，需要按經(jīng)驗確定每個RNA樣品中引物與RNA的比例。隨機引物的起始濃度范圍為50到250ng每20μl反應體系。因為使用隨機引物從總RNA合成的cDNA主要是核糖體RNA，所以模板一般選用poly(A)+RNA。
Oligo(dT)起始比隨機引物特異性高。它同大多數(shù)真核細胞mRNA 3"端所發(fā)現(xiàn)的poly(A)尾雜交。因為poly(A)+RNA大概占總RNA的1%到2％，所以與使用隨機引物相比，cDNA的數(shù)量和復雜度要少得多。因為其較高的特異性，oligo(dT)一般不需要對RNA和引物的比例及poly(A)+選擇進行優(yōu)化。建議每20μl反應體系使用0.5μg oligo(dT)。oligo(dT)12-18適用于多數(shù)RT-PCR。
基因特異性引物(GSP)對于逆轉(zhuǎn)錄步驟是特異性的引物。GSP是反義寡聚核苷，可以特異性地同RNA目的序列雜交，而不象隨機引物或oligo(dT)那樣同所有RNA退火。用于設計PCR引物的規(guī)則同樣適用于逆轉(zhuǎn)錄反應GSP的設計。GSP可以同與mRNA 3"zui末端退火的擴增引物序列相同，或GSP可以設計為與反向擴增引物的下游退火。
已經(jīng)制備好的雙鏈cDNA和一般DNA一樣，可以插入到質(zhì)?；蚴删w中，為此，首先必需有適當?shù)慕宇^(Linker)，接頭可以是在PCR引物上增加限制性內(nèi)切酶識別位點片段，經(jīng)PCR擴增后再克隆入相應的載體；也可以利用末端轉(zhuǎn)移酶在載體和雙鏈cDNA的末端接上一段寡聚dG和dC或dT和dA尾巴,退火后形成重組質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化到宿主菌中進行擴增。
本實驗是要從小鼠肝臟組織中獲取Fas配體基因，F(xiàn)as配體(FasL)是一分子量約為40u的II型跨膜糖蛋白，屬TNF家族成員。活化的T細胞可表達Fas和FasL，并通過Fas/FasL系統(tǒng)介導細胞凋亡作用，保持機體免疫系統(tǒng)的自穩(wěn)態(tài)。近年研究發(fā)現(xiàn)在部分癌細胞中FasL表達增強，并與腫瘤的復發(fā)轉(zhuǎn)移有關。我們采用RT-PCR方法克隆FasL全長cDNA并構建其表達載體，可以為進一步研究FasL的功能提供條件。在上下游引物的5’端分別加上了限制酶切位點及其保護堿基(即Hind III和BamH I)，以便可以通過雙酶切將目的片段定向的克隆到原核表達載體pGFPUv上(附錄圖4.3)。
為了便于后續(xù)實驗可以用金屬螯和層析的方法分離和純化目的蛋白，我們改造了pGFPUv，在其上加了6×His標簽。
【試劑與器材】
(一)試劑
1.總RNA(或mRNA)
2.RNA酶抑制蛋白(RNase Inhibitor) ：40 U/mL
3.dNTP 混合物 (各10 mM)
4.oligo(dT)12-18：2.5 ?mol/L
5.10*逆轉(zhuǎn)錄合成緩沖液(10?RT buffer)：250 mmol/L Tris-HCl (pH8.3)，375 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl2
6.AMV逆轉(zhuǎn)錄酶 5u/?L
7.基因特異性5’和3’引物各20 ?mol/L
8.Tap DNA聚合酶 5u/?L
9.10*PCR緩沖液：500mmol/L KCl，100mmol/L Tris•Cl，在25℃下，pH9.0，1.0% Triton X-100，15mmol/L MgCl2。
(二)器材
1)PCR儀，
2)PCR管，
3)微量移液器
【操作方法】
(一)逆轉(zhuǎn)錄：
1)建立RT反應體系：
2)渦旋混勻，42℃反應1小時，95℃加熱5分鐘，然后置于冰上。
(二)PCR擴增：
1)建立PCR反應體系：
2)將上述反應體系渦旋混勻, 按下列程序運行循環(huán)：
step2-4運行30個循環(huán)，其中復性溫度主要依據(jù)引物的不同而不同。
(三)取10-20uL PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，余下的PCR產(chǎn)物-20℃保存。
【注意事項與提示】
1.逆轉(zhuǎn)錄反應過程，需建立無RNAase環(huán)境，以避免RNA的降解。
2.成功的逆轉(zhuǎn)錄反應決定于高質(zhì)量的模板RNA。高質(zhì)量的RNA至少應保證全長并且不含逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制劑，如EDTA或SDS。此外，RT-PCR所遇到的一個潛在的困難是RNA中沾染的基因組DNA。使用較好的RNA分離方法，如Trizol Reagent，會減少RNA制備物中沾染的基因組DNA。因此在進行PCR反應時應該對每個RNA模板進行一個無逆轉(zhuǎn)錄的對照反應，以確定擴增出來的片段是來自基因組DNA還是cDNA。在無逆轉(zhuǎn)錄時所得到的PCR產(chǎn)物來源于基因組。
3.RT-PCR的起始模板可是總RNA或mRNA，都可以檢測到擴增結果(如下圖)。另外，分離mRNA會導致樣品間mRNA豐度的波動變化，從而使信息的檢出和定量產(chǎn)生偏差。然而，當分析稀有基因時，使用mRNA會增加檢測的靈敏度。
4.在逆轉(zhuǎn)錄反應中經(jīng)常加入RNA酶抑制蛋白以增加cDNA合成的長度和產(chǎn)量。RNA酶抑制蛋白要在*鏈合成反應中，在緩沖液和還原劑(如DTT)存在的條件下加入，因為cDNA合成前的過程會使抑制劑變性，從而釋放結合的可以降解RNA的RNase。RNA酶抑制蛋白僅防止RNase A，B，C對RNA的降解，并不能防止皮膚上的RNase，因此盡管使用了這些抑制劑，也要小心試驗者的手上Rnase對樣品的污染。
5.較高的保溫溫度有助于RNA二級結構的打開，增加了反應的產(chǎn)量。對于多數(shù)RNA模板，在沒有緩沖液或鹽的條件下，將RNA和引物在65℃保溫，然后迅速置于冰上冷卻，可以消除大多數(shù)二級結構，從而使引物可以結合。然而某些模板仍然會存在二級結構，即使熱變性后也是如此。對這些困難模板的擴增可以使用經(jīng)過改良的耐高溫逆轉(zhuǎn)錄酶， 如：Invitrogen 公司的ThermoScript逆轉(zhuǎn)錄酶，使逆轉(zhuǎn)錄反應置于較高溫度下進行以改善擴增。而且適當提高逆轉(zhuǎn)錄保溫溫度，可增加RT-PCR的特異性。
6.建立反應體系時，加完其它反應物后，才加模板DNA和Taq DNA聚合酶；然后將全部反應物渦旋混勻；上PCR儀前加礦物油封蓋或設熱蓋。
7.PCR反應的循環(huán)數(shù)一般25-30次就足夠了，過多的循環(huán)數(shù)會造成非特異性擴增和時間的浪費。復性溫度的計算，一般是在引物的Tm值上下浮動，Tm =2(A+T)+4(G+C)。適當提高復性溫度可提高PCR擴增的特異性。
8.不管是反轉(zhuǎn)錄反應還是PCR反應都應先調(diào)制試劑的Master Mix (包括RNase Free dH2O、緩沖液、dNTP Mixture等)，然后分裝到每個反應管中。這樣可使所取的試劑的體積更準確，減少試劑的損失，避免重復分取同一試劑，同時也可以減少實驗操作造成的誤差。而且分裝試劑時務*新Tip，以防止樣品間的污染。
9.AMV、RNase Inhibitor、Taq等酶類，要輕輕地混勻，避免起泡。分取之前要輕輕地離心收集到反應管底部，因其粘度高，所以要慢慢地分取。 酶類務必在實驗前從-20℃取出，使用后立即放回-20℃保存。
10.*的PCR條件，因PCR擴增儀的不同而不同，所以在使用您的樣品之前先做Control反應，以確定*的PCR條件。為延長PCR儀的使用壽命，應盡可能縮短PCR儀4℃保存的時間，盡量避免4℃過夜的情況。
Lane 1：總RNA 的 RT-PCR 產(chǎn)物(人細胞調(diào)亡因子TF15基因)
Lane 2： mRNA 的 RT-PCR 產(chǎn)物，人細胞調(diào)亡因子TF15基因
Lane 3： 100bp marker
【實驗安排】
1．*天：試劑的配制和所用一次性塑料制品和玻璃器皿的去RNase處理(0.1%DEPC浸泡或高溫干烤)。
2．第二天：進行(一)逆轉(zhuǎn)錄和(二)PCR擴增。
3．第三天：進行(三)瓊脂糖凝膠電泳檢測。
4．為了保證實驗質(zhì)量，能將總RNA提取、mRNA的分離純化、RT-PCR和cDNA文庫構建實驗安排在連續(xù)的時間內(nèi)進行。
【實驗報告要求與思考題】
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